Q779’s Blog

【生物】不同的限制酶有没有相同的识别位点和切点？   酶具有专一性，一般来讲每种限制酶都有他们所特异性识别的脱氧核苷酸序列。不过在研究中也发现有些不同的限制酶所识别位点和切点是一样的，这些酶称为同座酶。同座酶切割 DNA 时形成相同的末端，可以用 DNA 连接酶连接。如 Xma I 酶和 Sma I 酶都能识别 CCCGGG 序列，并在 C 和 G 之间切割 DNA。   同时，科学家还发现有这样的一类酶：他们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的黏性末端，称为同尾酶。常用的 Bam H I、 Bcl I 、 Bgl II 、 Xho I 就是一组同尾酶。它们切割 DNA 之后都形成由 GATC 四个核苷酸组成的黏性末端。这样，由于黏性末端相同，同尾酶切割后所产生的 DNA 片段，能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点，特称为杂种位点。由于杂种位点的存在使原来的酶切割位点不存在，一般不能再被原来的任何一种同尾酶所识别和切割。例如 Sal I （5’ – GTCGAC – 3’）和 Xho I （5’ –...

【生物】基因工程中单酶切和双酶切哪个更好？   在进行单酶切时，得到的目的基因与质粒两头的黏性末端是相同的。由于在进行连接反应时，目的基因和载体是随机碰撞的，且两者的黏性末端都相同。所以，目的基因既可以与质粒正向连接（正连），即目的基因顺时针地按其上游到下游的方向与载体相连，也可以与质粒反向连接（反连）。   为了防止出现反连现象，实验中常采用双酶切的方法。双酶切即采用两种不同的限制酶同时处理目的基因和质粒。因为限制酶具有特异性，不同的酶一般作用于不同的碱基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。这样当应用 DNA 连接酶进行连接时，就只能存在一种正连情况，而不会出现反连的现象。正因为可以有效地防止错误连接的现象出现，双酶切的做法被广泛应用于基因工程中表达载体的构建。

【生物】原核生物的限制酶为什么不剪切自身的DNA？   迄今已从 300 多钟不同的微生物中分离出约 4000 种限制酶。很多原核生物在生活中很容易收到外源 DNA 的入侵，在长期进化的过程中形成了一套完善的防御机制，以保持自身遗传物质的相对稳定性。限制性核酸内切酶在这个防御机制中就起着至关重要的作用。当外源 DNA 入侵时，限制酶就可以把这些 DNA 切割成小片段 DNA 分子，使其不能在生物体内表达。由于酶具有专一性，即每种限制酶都有它们特异性识别的脱氧核苷酸序列（如 Eco R I 限制酶只能识别 GAATTC 序列）。   细菌中的限制酶之所以不切割自身 DNA ，是因为微生物在长期进化过程中，使含有某种限制酶的细胞，其 DNA 分子中要么不具备这种限制酶的识别切割序列，要么通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能识别，从而不能将其切开。所以尽管细菌中含有某种限制酶也不会将自身的 DNA 切断，并且可以防止外源 DNA 的入侵。

【生物】母体为什么不会排斥外来移植胚胎？ 省流：还不知道。 目前提出的解释子宫出于免疫豁免状态的机制主要包括： 滋养层的机械屏障作用 妊娠期间母体的免疫功能受到了一定的抑制 滋养层中缺乏 MHC I 类分子 细胞因子功能的转换 由 Fas/FasL 系统介导的局部免疫抑制 （Fas 是能够结合到死亡受体 TNFRSF6/FAS 的细胞因子，在 T 细胞发育中介导由细胞毒性引起的凋亡）

【生物】核移植操作时为何将“供体细胞”直接注入去核卵母细胞？   标题指的是选必三书上P53的核移植技术的那张图里，“将供体细胞注入去核的卵母细胞”这个步骤。   常用的细胞核移植方法主要有两种，即细胞质内注射和透明带下注射。前者是用微型注射针将供体细胞的细胞核吸出，再注入去核卵母细胞质内；后者是直接将酮体细胞注入去核卵母细胞透明带内，然后用病毒介导或者电脉冲等方式使两个细胞融合，因为这种方法操作简便，对卵母细胞损伤较小，现在较为常用。我国科学家于2017年底培育出的体细胞克隆猴“中中”和“华华”采用的就是后一种方法。   就目前的研究经验来看，不取出细胞核、直接注射供体细胞的原因是：在确保供体细胞质对重构胚的发育影响不大的前提下，可以简化操作、减少对卵母细胞的损伤（提示：因为前一种方法需要直接注入细胞质中），提高成功率。

【生物】细胞培养一代等于细胞分裂一次吗？   原代细胞生长到一定时间后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时就需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代。传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。在细胞培养时，所谓细胞“一代”，仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法。如某一细胞系为第 114 代细胞，即指该细胞系已传代 114 次。它与细胞世代或倍增不同。在细胞一代中，细胞就能倍增 3~6 次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期（如图所示）。当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养；否则，细胞会中毒，发生形态改变甚至死亡。

【生物】为什么胚胎分割份数越多，移植成功率越低？   早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到，其细胞数目也是有限的。分割的份数越多，每一份的细胞数会越少，不但难以做到均等分割，而且囊胚期的胚胎内细胞团细胞所受的影响会越大。因此，分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后恢复和发育的难度也会越大，移植成功率自然会降低。

【生物】动物细胞培养为什么要分散成单个细胞？   在进行细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）或组织块培养，但经传代培养后，最终都要分散成单个细胞培养。这样做的优点是，细胞所需的营养容易供应，其代谢的废物容易排出，同时便于实现细胞水平操作的技术等。

【生物】有限细胞系和无限细胞系分别有什么用？ 有限细胞系源自原代培养的正常细胞，未经永生化处理，增殖能力有限（遵循Hayflick极限，传代约20-50次），遗传稳定且接近原始组织，适用于短期实验（如药物毒性测试）。 无限细胞系通过基因突变或永生化技术（如病毒转化、端粒酶激活）打破增殖限制，可无限传代，但可能积累突变，异质性高，常用于长期研究和大规模生产（如抗体、疫苗）。 特征 有限细胞系 无限细胞系（永生化细胞系） 来源 原代细胞，未永生化 基因突变/人工永生化（如SV40、hTERT） 增殖能力 有限（约20-50代后衰老） 无限增殖 遗传稳定性 高，接近原始组织 低，易发生突变或异质性 制备复杂度 简单（仅原代培养） 复杂（需基因编辑/病毒转化） 应用场景 短期实验、生理功能模拟 长期研究、工业化生产 典型例子 WI-38（人胚胎肺细胞） HeLa（宫颈癌细胞）、CHO（抗体生产） 有限细胞系保留正常增殖调控，适合短期高保真实验；无限细胞系突破增殖限制，适合长期应用但遗传稳定性较低。

【生物】什么是细胞株和细胞系？   体外培养的动物细胞可以分为原代细胞（primary culture cell）和传代细胞（subculture cell）。原代细胞是指从机体取出来后立即培养的细胞；适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。   原代培养（primary culture）又称初代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官的第一次的培养物（原代细胞）。其最大优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。原代培养所有机能上的改变主要是表型（phenotype）上的改变，不一定为体细胞突变。原代培养物开始第一次传代培养后的细胞称为细胞系（cell line），便不再称为原代培养。如果细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finite cell line）；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，称为连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已经是发生转化的细胞系。无限细胞...

【生物】动物细胞融合为什么要用多个细胞？ 以目前常用的细胞融合方法，融合率都不可能是 100% 只用最少两个细胞效率低且可能无法得到需要的杂交细胞 后者参考 单抗制备过程为何进行两次专一抗体检测？ 可知

【生物】胚胎移植为什么要隔 2~3 个月再作另一次移植？ 标题的 2~3 个月指的是书上的奶牛胚胎移植，供体奶牛需要隔 2~3 个月再进行超数排卵，或正常繁殖。 超数排卵处理过程中需要用极速处理，这种处理会影响牛本身的内分泌活动，因此超数排卵处理对母牛来说是一次极大的应激，处理后奶牛需要有一个恢复的过程，使其体内的激素调节等生理功能重新趋于正常。超数排卵间隔时间短，供体的生殖系统不能得以完全恢复，体内激素调节功能尚未恢复正常，重复超数排卵效果不稳定。实验表明，每次间隔三个月左右进行多次（一般至多 6 次）重复超数排卵是可行的。不过，也有间隔一个月进行超数排卵的例子，也取得了不错的效果，但是只进行了 2 次。 在收集供体牛的胚胎时一般采用非手术方法，即用大量的生理盐水冲洗子宫角，这会影响子宫内环境，对胚胎着床不利。在用生理盐水冲洗子宫角时，为防止感染，经常在冲胚最后用抗生素处理（子宫内灌注抗生素，连用 3 天），这对着床也不利。因为是非手术冲胚，不能保证所有胚胎都被冲出来，个别胚胎有可能着床正常繁殖。有时会用前列腺素（PG）处理，融掉黄体，避免未冲出来的胚胎着床。 另有文献表明...